ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных.

Актуальность темы. На сегодняшний день основными источниками для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология переработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Расширение областей применения данных биополимеров обуславливает поиск новых перспективных источников хитина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ, в том числе и хитина, с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить кутикулу личинок восковой моли - Galleria mellonella L, в большом количестве паразитирующих в пчелиных ульях.

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возросло изучение этих природных полимеров. На сегодняшний день известно более 200 областей применения

хитина и хитозана, в том числе и в медицине. Нарушение липидного метаболизма в организме человека может привести к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение и др. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен.

биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др. что открывает перспективы его использования в качестве ингибитора липолитических ферментов.

По данным многих исследователей хитозан обладает антимикробным эффектом в отношении многих патогенных микроорганизмов. Однако данных о чувствительности к хитозану возбудителей туберкулеза на сегодняшний день нет. Изучение противотуберкулезных свойств ферментативно полученных препаратов с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных хитозанов на клетках микобактерий позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера связанного с использованием хитозана в медицине и ветеринарии для борьбы с туберкулезом.

Целью настоящей работы разработка биотехнологической схемы переработки личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ, как экстракт, хитин-меланиновой комплекс и хитозан. Изучение противотуберкулезных свойств хитозана и его взаимодействия с липолитическими ферментами.

Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:

1. Разработать технологию переработки восковой моли с учетом

особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии

обработки;

2. Согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку кутикулы личинок восковой моли с получением интересующих биологически активных веществ;

3. Исследовать противотуберкулезные свойства хитозана с различной молекулярной массой;

4. Изучить взаимодействие хитозана с липолитическими ферментами;

Научная новизна работы. Обосновано использование личинок восковой моли для получения различных биологически активных веществ. Впервые разработана комплексная технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана.

Показано, что хитозан обладает антибактериальной активностью в отношении микроорганизмов рода Mycobacterium. Хитозан с низкой молекулярной массой обладает наибольшей антибактериальной активностью. С увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана снижается. Установлена прямая зависимость гибели клеток микобактерий от времени взаимодействия с хитозаном.

Впервые показано, что хитозан является конкурентным ингибитором липолитических ферментов. Найдены кинетические константы ингибирования липаз. Ингибирование липолитической активности происходит за счет гидрофобных взаимодействий между хитозаном и липазами, вклад электростатических взаимодействий в комплексообразование ингибитора с липолитическими ферментами незначителен.

Практическая значимость работы. Разработана комплексная схема

переработки кутикулы личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ как экстракт, хитин и низкомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии переработки кутикулы.

Показано, что хитозан обладает, как минимум, бактериостатическим действием по отношению к возбудителям туберкулеза М. bovis и М. avium и может быть рекомендован для профилактики туберкулеза в промышленных птицеводческих и животноводческих хозяйствах.

Показано, что низкомолекулярный хитозан является конкурентным ингибитором липаз, в том числе, и панкреатической липазы. Данный результат может иметь практическое значение при создании препаратов для лечения и профилактики нарушений липидного метаболизма приводящего к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение в организме человека

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8-й Международной научной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006), Международной научно-практической конференции "Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения.

(Antalya, Turkey, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел с обсуждением экспериментальных результатов, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков, библиографию из 250 наименований, из них 203 на иностранном языке.

Список используемых в диссертации сокращений:

СД - степень деацетилирования

СП - степень полимеризации

Мг| - молекулярная масса полимера

Mw - средневесовая молекулярная масса полимера Мп - среднечисловая молекулярная масса полимера Ip (Mw/Mn) - индекс полидисперсности ХМК - хитин-меланиновый комплекс

БМК - белок-меланиновый комплекс

ХзМК - хитозан-меланиновый комплекс

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ГХ - гидрофобная хроматография

МХАХ - металл-хелат аффинная хроматография

ИДК - иминодиуксусная кислота

МБТ - микобактерии

МИК - минимальная ингибирующая концентрация МПА - мясо-пептонный агар

1.