Определение прочности связывания хитозана с клетками M.smegmatis
Для определения прочности связывания хитозана с клетками M.smegmatis использовали трехкратную отмывку клеток бактерий предварительно проинкубированных при температуре 37°С с хитозаном с Мг| равной 4 кДа и СД 85%, смесью из 0,1 М ацетатного буфера (pH 6,8) и 0,5 М NaCl.
Результаты предварительных опытов показали, что 0,5 М NaCl не вызывает гибели микобактерий. В то же время не исключено, что хлорид натрия способен разрушить ионные взаимодействия, возникшие в течение 1- часовой инкубации между клетками М. smegmatis и хитозаном, вследствие чего хитозан перейдет в супернатант, и, как следствие, после отмывки количество жизнеспособных клеток увеличится. Однако данные этого опыта показали, что воздействие хлорида натрия не оказывает существенного влияния на связывание хитозана с микобактериями. Выживаемость клеток осталась без изменений (результаты не приводятся).В результате колориметрических исследований было показано, что количество хитозана в супернатанте было минимальным, то есть практически весь хитозан остался связанным с микобактериями. Таким образом, можно сделать вывод, что хитозан в силу своей поликатионной природы, прочно связан с внешней мембраной микобактерий электростатическими и другими силами.
Кроме того, была сделана попытка «снять» с клеток М. smegmatis
хитозан с помощью детергентов. Использование 0,1%-ных растворов Твин 20 и Твин 80 для отмывки клеток микобактерий от хитозана, показало, что детергент сам по себе вызывает гибель клеток на 20% (Твин 20) и на 42% (Твин 60). Известно, что аналогичным образом используемые нами детергенты вызывали гибель клеток Ent. agglomerans при отмывании от хитозана [129].
3.2.5.