Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от времени взаимодействия с экстрактом восковой моли

Для изучения зависимости гибели клеток микобактерий от времени взаимодействия с экстрактом, пробы отбирали через 15, 30, 60, 90 и 120 минут (рис.9). Было показано, что достаточно 60 мин контакта экстракта в концентрации 1 мг/мл по белку, с культурой М.

времени инкубации с экстрактом в течение 90 мин. составляла 60%. При увеличении времени экспозиции до 120 мин гибель клеток увеличивалась незначительно.

Рис. 9. Гибель бактерий М. smegmatis (% от общего количества клеток) при взаимодействии с экстрактом при 37 °С и pH 6,5 в зависимости от времени экспозиции (мин)

Необходимо отметить, что с увеличением антибактериальной активности, росли значения липолитической активности (данные не приводятся). После кипячения препараты обладавшие антибактериальной активностью, теряли активность. Следовательно, ответственной за антибактериальное действие можно считать белковую составляющую экстракта. Согласно литературным данным, на сегодняшний день известен ряд препаратов обладающих широким спектром антибактериальной активности выделяемых из насекомых. Известно, что большинство из них имеют белковую природу [232-234]. С учетом этого была проведена очистка экстракта полученного из восковой моли.

33.2. Фракционирование экстракта восковой моли

С целью выделения фактора ответственного за противотуберкулезную активность, было проведено биохимическое фракционирование экстракта личинок восковой моли (таблица 17). Экстракт получали в результате гомогенизации личинок восковой моли в изотоническом растворе NaCl. На каждом этапе очистки определяли степень антибактериальной активности в

отношении М.

Таблица 17.

Фракционирование экстракта выделенного из восковой моли

Необходимо отметить, что значения липолитической активности коррелируют со степенью антибактериальной активности.

Нами была поставлена задача, получить из экстракта восковой моли фракцию, обладающую максимальной антимикробной активностью в отношении тест-культуры М. smegmatis.

Первоначально нами была проведена экстракция этилацетатом, позволяющая отделить липиды и липопротеиды от экстракта. Липидная фракция в отличие от водной, не проявляла антибактериальной активности, а наоборот стимулировала рост клеток микобактерий, вероятно, выступая в качестве дополнительного питательного компонента.

Далее водная фракция экстракта освобожденного от липидных составляющих была подвержена сульфат аммонийному высаливанию со степенями насыщения 30%, 45%, 60% и 85%. Из полученных фракций максимальной антибактериальной и липолитической активностью обладала фракция, выделяемая 45% насыщением сульфатом аммония. Эта фракция была подвержена хроматографической очистки. Первая стадия очистки

была проведена на колонке с гидрофобным сорбентом бутил-тойоперл. Выбор колонки был обусловлен тем, что в гидрофобной хроматографии сорбцию проводят в присутствие сульфат ионов. Поэтому отобранную после сульфат аммонийного высаливания фракцию наносили на колонку уравновешенную 0,05 М Na-фосфатным буфером, содержащим 0,9 М сульфата натрия. После нанесения и промывания уравновешивающим буфером белки элюировали в ступенчатом градиенте концентрации 0,3 и 0,1 М сульфата натрия.

Учитывая, что одностадийное фракционирование редко позволяет получить высокую степень очистки, мы планировали проведение следующей стадии очистки - металл-хелат аффинной хроматографии. Так как в металл-хелат аффинной хроматографии использование аммонийных ионов нежелательно, хроматографию на колонке бутил-тойоперл проводили в присутствии сульфата натрия. Фракция с максимальной липолитической и антибактериальной активностью, элюировалась на гидрофобной колонке в буфере с сульфатом натрия в концентрации 0,1 М.

Предварительно было изучено хроматографическое поведение полученной с гидрофобной колонки фракции на иминодиуксусной (ИДК)- агарозе заряженной ионами Cu(II) и Ni(II). Было показано, что белки с максимальной антибактериальной и липолитической активностями не обладают сродством к иммобилизованным ионам Ni(II), но при этом сорбируются на ИДК-Си(П) агарозе и элюируются при добавлении в буфер 0,05 М имидазола. Известно, что на ИДК-колонках заряженных ионами Cu(II) сорбируются белки, имеющие хотя бы единственный поверхностно экспонированный остаток His, в то время как для сорбции на ионах Ni(II) требуется наличие в молекуле белка сближенных остатков His во вторичной и третичной структуре, способных образовывать координационные связи с ионами металлов.

Учитывая, что на №(П)-ИДК колонке сорбировалась часть балластных белков, следующую стадию очистки было решено проводить в тандеме

колонок на №(И)-ИДК-Си(Н)-ИДК агарозе, в режиме on-line. Для предотвращения ионообменных взаимодействий в буфер добавляли 0,2 М NaCl. После нанесения белка и промывки, колонки рассоединяли. С Cu(II)- ИДК колонки элюцию проводили последовательным добавлением 0,05 М и 0,25 М имидазола. Фракция элюированная с добавлением 0,05 М имидазола обладала максимальной липолитической и антибактериальной активностью. Суммарная очистка экстракта после стадии сульфат аммонийного высаливания составила 1,5 раза, а после двух хроматографических стадий очистки - гидрофобной и металл-хелат аффинной степень очистки составила 29 раз.

В результате проведенного фракционирования получить фракцию, содержащую индивидуальный белок, обладающую антибактериальной активностью, не удалось. Однако была получена фракция с высокой степенью очистки содержащая набор белков с различными молекулярными массами (рис. 10).

Рис. 10. SDS-электрофорез в 12%-ном ПААГ. Окраска брилиантовым синим R-250. Обозначения: 1 - Экстракт без липидов и липопротеидов; 2- фракция полученная 45% высаливанием (NH₄)₂SO₄; 3 - маркерные белки с молекулярной массой (кДа): 21, 31, 45, 66, 97; 4 - фракция элюированная с гидрофобной колонки в буфере с 0,1 М Na₂SO₄; 5 - фракция элюированная с гидрофобной колонки в буфере с 0,3 М Na₂SO₄; 6 - фракция элюированная с Cu-ИДК колонки в буфере с 0,05 М имидазола; 7 - фракция элюированная с Cu-ИДК колонки в буфере с 0,25 М имидазола

Таким образом, в результате последовательного фракционирования экстракта восковой моли была получена фракция, обладающая

максимальной антибактериальной активностью в отношении атипичного штамма М. smegmatis. Показано, что с увеличением антибактериальной активности росла и специфическая липолитическая активность. На основании полученных данных можно сделать заключение, что за антибактериальную активность экстракта ответственны вещества белковой природы, в том числе и липазы. Эти ферменты, способны разрушать некоторые жизненно важные для микобактерий липиды и другие содержащие сложноэфирные связи, видоспецифические молекулы, что могло привести к гибели бактерий, в результате повреждения липидного слоя клеточной стенки.

3.4.