1.3 Основные источники хитина и хитозана 1.3.1 Ракообразные (Crustacea)
В настоящее время основными источниками для получения хитина и хитозана являются членистоногие, а именно ракообразные. Одним из наиболее популярных источников сырья в промышленном масштабе
остаются отходы от переработки морских панцирьсодержащих гидробионтов: крабы, креветки, лобстеры и др.
Главной особенностью такого сырья является отсутствие затрат на его разведение и выращивание. Первые затраты возникают с началом добычи. Согласно опубликованным в 2000г. данным Международной продовольственной организации ФАО, промыслом морских гидробионтов занимаются всего 133 страны. Группа стран-лидеров, на которую приходится более половины мировой добычи, представлена двумя странами - Китай и США. К настоящему времени уровень ежегодного мирового производства хитина оценивается в 3700 т, а хитозана - 2000 т. Из них на долю отечественного производства приходится 80 тонн в год [45]. Хитин в панцире ракообразных присутствует в a-форме и образует нанофибриллы диаметром 3 нм, содержащие по 19 молекулярных цепочек длиной около 0,3 мкм [46]. В панцире хитин образует комплексы с белками (до 50%), взаимодействуя с аспарагиновой кислотой и/или остатками гистидина, минералами (аморфные карбонаты и фосфаты кальция) и пигментами (лютеин, 3-каротин, антаксантин), придающими механическую прочностью и упругость [47]. В России основными источниками хитинсодержащего сырья являются:Крабы
Крабодобывающие предприятия Дальнего Востока в качестве сырья для производства хитина и хитозана заготавливают панцирь головогруди и конечностей следующих видов крабов: камчатского краба (Paralithodes camtschaticus), синего краба (Paralithodes platypus), равношипого (Lithodes aequispina), крабов-стригунов опилио (Chionoecetes opilio) и бэрди (Chionoecetes bairdi). Химический состав панциря крабов и других ракообразных представлен в таблице 1. Значительный интерес в качестве сырья для получения хитина и хитозана представляют запасы панцирей крабов, законсервированные в естественных условиях на побережье в районах их промысла.
Это восновном панцири крабов, сброшенные с крабообрабатывающих плавбаз, и панцири, остающиеся после линьки и естественной гибели крабов [45].
Криль (креветки)
Одним из перспективных источников для России может служить антарктический криль (Euphausia superba Dana), массовые скопления которого находятся в Атлантическом, Тихоокеанском и Индоокеанском секторах Антарктики. По некоторым оценкам его запасы составляют 50 млн. т, а выход хитина после обработки криля-сырца - около 1%. Сегодня мировой вылов криля оценивается в 100 тыс. т. Таким образом, можно увеличить мировой вылов морских панцирьсодержащих за счет криля на 36-40%. В настоящее время сырьевая база криля могла бы обеспечить почти круглогодичный промысел [48]. Состав антарктического криля представлен в таблице 1.
Гаммарус
Одним из наиболее массовых и легко добываемых объектов является рачок-бокоплав, Gammarus (Rivulogammarus) lacustris Sars, обитатель Балтийского моря, озер и рек, Куршского и Вислинского заливов Калининградской области, широко распространенный в озерах Западной Сибири и Челябинской области. Его запасы исчисляются тысячами тонн, а вылов не сопряжен с нарушением биологического равновесия в водоемах. Относительно высокое содержание хитина (25-30%) и малая толщина панциря (100-500 мкм) облегчают процесс его переработки для получения хитина и хитозана [49]. Химический состав гаммаруса представлен в таблице 1[45]. Панцири ракообразных довольно дорогостоящее сырье, цена которого зависит от сезонности, и связана с возрастом и биологическим видом. В последнее время особенно важным фактором стала загрязненность панцирей тяжелыми металлами, ядохимикатами и другими ядовитыми отходами ряда производств.
Таблица 1.
Химический состав морских и пресноводных ракообразных
| Вид сырья | Содержание, % на сухое вещество | ||||
| Влага, % | Общий азот | Липиды | Минеральные вещества | Хитин | |
| Панцирь краба | 9,7 | 5,9 | 0,9 | 33,8 | 32,4 |
| Панцирь креветки | 9,8 | 6,7 | 13,9 | 24,8 | 9,7 |
| Панцирь речного рака | 8,0 | 5,8 | 9,0 | 42,0 | 35,0 |
| Гаммарус сушеный | 10,0 | 8,7 | 7,7 | 26,1 | 6,6 |
| мороженый | 77,2 | 9,04 | 14,1 | 20,9 | 6,2 |
| Антарктический криль | 73-77 | до 45 | 2,0-3,2 | 2,6-3,0 | 2,8-4,5 |
| Гладиус кальмара | - | - | 2-5 | 0,5-2 | 28-35 |
Кроме того, получение хитина из ракообразных может быть рентабельным только при условии одновременного извлечения всех полезных веществ, которые содержатся в панцире.
Поэтому существует необходимость поиска новых сырьевых источников. В этом отношении особого внимания заслуживают такие хитинсодержащие организмы, как мицелиальные грибы, водоросли, насекомые.1.3.2 Грибы {Fungi}
Клеточная стенка почти всех грибов, за исключением Acrasiales, содержит хитин. Содержание хитина у грибов подвержено значительным колебаниям в зависимости от условий культивирования и систематического положения организма и составляет от 0,2 до 26%. К примеру, содержание хитина на грамм сухой биомассы у Aspergillaceae составляет 20-22%, у Penicillium - 4-5,5%. У высших грибов содержание хитина от 3 до 5%, у плодового тела белого гриба - 6,7%. Содержание хитина неодинаково даже у грибов, относящихся к одному роду.
Например, у семейства Aspergillaceae вид A. flavus содержит до 22% хитина, A. niger — 7,2%, a A. parasiticus -15,7%. Количество хитина у некоторых грибов довольно значительно меняется и в пределах вида, например, у разных штаммов A.niger от 11,7 до 24%. В пекарских дрожжах глюкозоамин был найден еще в 1915 г. Установлено, что этот полисахарид присутствует у 29 видов дрожжей, кроме Schizosaccharomyces [50]. Хитин в дрожжах присутствует в a-форме в количестве 1-3% и имеет среднюю молекулярную массу около 25 кДа [51].
Клеточная стенка грибов представляет собой систему микрофибрилл, встроенных в аморфный матрикс. Такие фибриллы или скелетные компоненты могут быть построены из целлюлозы, глюкана и хитина в зависимости от видовой принадлежности грибов. Остальные полисахариды, белки, пигменты, липиды служат цементирующими веществами, образующими химические связи с микрофибриллярной частью клеточной стенки. [3-1,3-Глюканы образуют наиболее прочный комплекс с хитином за счет ковалентных связей, называемый хитин- глюкановым комплексом (ХГК), который составляет «скелет» грибной клетки [50].
Хитин из грибов можно получать двумя способами: путем целенаправленной ферментации и из отходов производств (получение органических кислот, ферментов, антибиотиков).
Отделение глюканов от хитина затруднительно, поэтому более целесообразно получение хитин- глюкановых и хитозан-глюкановых комплексов. Также можно выделять напрямую хитозан, который входит в состав клеточной стенки некоторых мицелиальных грибов: Mucor sp, Rhizopus sp, Absidia coerulea, A. glauca, A. orchidis [52,53]. В таблице 2 приведены количественные значения содержания хитозана и его характеристики у различных видов грибов [54].
Таблица 2.
Характеристика хитозана у различных видов грибов
| Вид грибов | Хитозан, % | СД, % | Mr|, к Да |
| Aspergillus niger | 11 | 90 | 140 |
| Rhizopus oryzae | 14 | 87 | 69 |
| Lentinus edodes | 3,3 | 86 | 190 |
| Pleurotus safo-cafu | 1,2 | 83 | ПО |
| Zygosaccharomyces rouxii | 3,6 | 85 | 27 |
| Candida albicans | 4,4 | 83 | ПО |
1.3.3. Насекомые (Insects)
Обнаружение новых свойств хитина и хитозана, расширение областей их применения обусловливают поиск новых источников сырья. Одним из потенциальных источников природных полисахаридов является кутикула насекомых. Насекомые - самый многочисленный класс животного мира, насчитывающий более 1млн. видов.
Химический состав кутикулы
Основным компонентом кутикулы является хитин. Хитиновый покров отличается механической прочностью, химической стойкостью, превышающей стойкость клетчатки, незначительной проницаемостью и большой упругостью.
В кутикуле членистоногих смежные молекулярные цепочки хитина объединяются в строго организованные нитчатые или пластинчатые мицеллы за счет образования водородных связей. При помощи водородной связи также соединяются атомы кислорода смежных остатков ацетилглюкозамина. Молекулярные цепочки хитина, состоящие из 18-25 остатков N- ацетилглюкозамина, организуются в 2-3 ряда и образуют простые кристаллические стержни, а белки в виде p-слоев связываются по периметру хитиновых кристаллов с формированием фибрилл [55]. Мицеллы хитина разделены тонкими пространствами, в которых помещаются инкрустирующие вещества. Количество хитина в кутикуле не превышает 50%. Хитин также содержится и в других отделах теланасекомых (выстилке крупных трахей, одноклеточных железах, в перитрофической оболочке). Содержание хитина в покровах различных насекомых представлено в таблице 3 [56,57].
Таблица 3.
Содержание хитина в % от сухого веса в покровах насекомых
| Характер покрова | Хитин, % | Характер покрова | Хитин, % |
| Жесткокрылые ( Coleoptera) Надкрылья: - колорадский жук | 32,2 | Полужесткокрылые (Hemiptera) Надкрылья: - клоп-солдатик | 27 |
| - майский жук | 33,9 | - цикада | 25 |
| - жук - олень | 40 | Чешуекрылые | |
| - жужелица | 36,1 | (Lepidoptera) | 33,7 |
| - мучной хрущ | 29 | - кутикула гусеницы | |
| - плавунец | 34,5 | восковой моли | |
| окаймленный | Двукрылые (Diptera) | 54,9 | |
| - водолюб черный | 32,4 | - кутикула личинки | |
| Кутикула личинки: - мучной хрущ - майский жук | 33 33,5 | мясной мухи - куколка мясной мухи Прямокрылые | 32,5 |
| (Orthoptera) - кутикула таракана | 35 |
Белки составляют от 25 до 50% сухого материала кутикулы членистоногих.
Растворимая в воде фракция белков кутикулы артроподин в соединении с хитином формирует полимерный комплекс и является наиболее характерным компонентом прокутикулы. Нерастворимая в воде фракция белков представлена несколькими соединениями, в том числе белком резилином, который накапливается в эластичных участках покровов. К числу водонерастворимых белков относится и кутикулин - липопротеин, входящий в состав эпикутикулы.Липиды, сосредоточенные в восковом слое эпикутикулы, представлены широким набором химических соединений: свободные жирные кислоты и их эфиры, углеводороды, диоловые спирты и стерины. Содержание липидов у разных насекомых различное (3,5-22%) [58]. Из
неорганических веществ чаще всего встречаются нейтральные соли кальция (СаСОз, Са3(РО4)2, которые образуют комплексы с белком. Содержание минеральных веществ невелико и не превышает 1-3% [59].
Окраска и пигменты покровов
Различают структурную и пигментную окраски насекомых. Структурная окраска связана со специфическими особенностями микроскопического строения кутикулы, которая создает эффекты интерференции, дифракции и рассеивания света. Пигментная окраска создается красящими веществами, которые откладываются в экзокутикуле (кутикулярная окраска), существуют в виде гранул в клетках эпидермиса (эпидермальная окраска) или находятся в гемолимфе, жировом теле и кишечнике (субэпидермальная окраска). Пигменты насекомых по присутствию или отсутствию атомов азота можно разделить на две категории. Безазотистые пигменты (каротиноиды, флавоноиды, антрахиноны), как правило, заимствуются насекомыми из растительной пищи. Азотсодержащие пигменты (птерины, оммохромы, меланины) синтезируются самими насекомыми.
Меланины - высокомолекулярные пигменты (до 200кДа) сетчатой нерегулярной структуры, широко распространены в природе - в микроорганизмах, грибах, растениях, организме животных и человека [60]. Они относятся к одному из классов конденсированных фенольных соединений, образующихся в результате ферментативного окисления, аутоокисления и поликонденсации многих простых фенольных предшественников [61].
В отличие от позвоночных, меланины насекомых являются внеклеточными пигментами. Они не образуют окрашенные гранулы в цитоплазме живых клеток, а пропитывают экзокутикулу, создавая темно- коричневую, коричневато-красную или черную окраску покровов насекомых, а также являются стабилизирующим элементом. Меланизация кутикулы протекает особенно интенсивно в наиболее
толстых и склеротизованных её участках. Полагают, что синтез меланинов служит средством избавления организма насекомого от ядовитых фенольных соединений, образующихся при склеротизации кутикулы [58]. Меланины различного происхождения отличаются химической стабильностью и инертностью, нерастворимы в воде и устойчивы к действию кислот, растворимы в щелочных растворах. Также эффективно поглощают свет в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области спектра, что обусловливает темную окраску, и образуют комплексы с аминокислотами, белками, катионами металлов, антибиотиками. Абсорбция света меланинами имеет некоторые биологические функции, включая фоторецепторное экранирование, терморегуляцию, фотозащиту, маскировку и приобретение покровительственной окраски [62]. Характерным свойством меланинов является присутствие высокостабильных парамагнитных центров, что обусловлено наличием неспаренных электронов, участвующих в дезактивации лабильных свободных радикалов и других активных форм кислорода, а также в хелатировании металлов с переменной валентностью [63]. Пигменты обладают антиоксидантными, радио- и фотопротекторными, электронно- и ионообменными свойствам [64]. Принято считать, что окислительно-восстановительные свойства обусловлены способностью пигментов существовать в окисленной (хиноновой) и в восстановленной (гидрохиноновой) формах, выступая в качестве полупроводника в биохимических процессах. Природные меланиновые пигменты проявляют противоопухолевую, антибактериальную, иммуномодулирующую, генопротекторную и гепатопротекторную активность [65].
1.3.4 Нетрадиционные источники Водоросли
Клеточная стенка некоторых зеленых водорослей (Ulva lactuca,
Volonia ventricosa, Cladophora glomerata, Oedogonium crassum) состоит из двух компонентов: аморфного слизистого матрикса и погруженного в него фибриллярного опорного компонента, состоящего из хитина [66,67]. У диатомовых одноклеточных водорослей (Baciacillariophyta) клеточный покров состоит из кремнеземного панциря и тонкого органического пектинового слоя, обрамляющего панцирь. Некоторые виды центрических диатомовых, такие как талассиозира (Thalassiosira antarctica, nordenskioldii, fluviatilis) и циклотелла (Cyclotella cryptica), образуют рыхлые цепочки посредством слизистого тяжа, соединяющего центры смежных створок и состоящие из чистого полностью ацетилированного хитина, не связанного с другими внеклеточными компонентами [68].
Хитин из водорослей можно получать методом, описанным для гидроидов. Однако получаемый хитин качественно отличен: обладает наиболее высокой степенью кристалличности, высоко ацетилирован и имеет P-структуру. Из диатомовых водорослей получают хитиновые волокна, выход которых составляет 7-10% [68]. Однако все попытки культивировать эти водоросли в искусственных условиях не являются экономически выгодными, так как выход биомассы водорослей оказывается очень незначительным.
Гидроид
Гидроид, Obelia longissima — биолюминисцентный гидроидный полип, растущий на камнях, створках раковин, ламинариях, гидросооружениях. Образует густые многоярусные колонии (столоны и побеги), снаружи защищенные тонкостенной, но прочной защитной трубкой (текой), состоящей из хитина. Существует возможность получать хитин из гидроидов до 10-14%, представляющий собой белый волокнистый материал с высокой степенью кристалличности и ацетилирования. Такое сырье можно легко культивировать в условиях моря или разводить искусственно [69].