Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гомогенных водных растворах

Для выяснения механизма каталитического действия липолитических ферментов первоначально лучше проводить исследования с водорастворимыми субстратами. При кинетическом анализе липолиза в гомогенной водной фазе не возникает осложнений, которые связаны с наличием поверхности раздела фаз.

Подбор оптимальных параметров ферментативной реакции в гомогенных водных растворах

В результате изучения влияния Мц хитозана от 5-94 кДа на степень ингибирования активности липазы из С.rugosa, было показано, что максимальное снижение активности наблюдалось при действии хитозана с молекулярной массой 6 кДа и менее (таблица 18). В дальнейших исследованиях мы использовали хитозан с Мц порядка 5-6 кДА. Полученные результаты согласуются с литературными данными, полученными Tsujita Т., о том, что хитозан с Мц 10 кДа ингибирует активность панкреатической липазы лучше, чем хитозан с Мц 46 кДа [243].

Таблица 18.

Зависимость значений констант ингибирования липазы C.rugosa от молекулярной массы ингибитора

Для оптимизации условий измерения констант ингибирования липаз хитозаном первоначально оценивали оптимальное время преинкубации фермента и ингибитора перед началом ферментативной реакции.

Время преинкубации варьировали от 5 до 120 мин. Степень

ингибирования обеих липаз зависела от времени преинкубации вплоть до 30 мин, после чего оставалась примерно постоянной. Поэтому далее величина времени преинкубации соответствовала 30 мин.

Время преинкубации, мин

Рис.11. Зависимость ферментативной активности липазы C.rugosa (1) и проростков пшеницы (2) от времени преинкубации с хитозаном при pH 6,7 иЗО°С

На рис. 12 показана зависимость активности липазы C.rugosa и проростков пшеницы от величины pH.

Рис.12. Зависимость ферментативной активности липазы C.rugosa (1) и проростков пшеницы (2) от pH реакционной смеси при 30°С

рн

Максимальная активность ферментов при использовании в качестве

субстрата паранитрофенил пальмитата достигалась при pH 6,7.

Последующие измерения константы ингибирования обеих липаз были выполнены при pH 6,7.

Определение кинетических констант

Зависимости начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазами от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствие ингибитора описываются уравнением Михаэлиса-Ментен, после линеаризации, которого в координатах Лайнуивера-Берка были определены максимальные скорости гидролиза субстрата и константы Михаэлиса К_т.

На рис. 13 приведена зависимость в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой С.rugosa и проростков пшеницы от концентрации субстрата в отсутствии (прямые 1) и в присутствии хитозана (прямые 2).

Рис.13. Графики зависимостей в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой С.rugosa (а) и проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в

присутствии хитозана (2) при pH 6,7 и 30°С.

Проекция прямых на ось абсцисс позволила определить конкурентный тип ингибирования липаз хитозаном. Найденные значения константы

скорости kcaf, константы Михаэлиса К_м и константы ингибирования К,- липаз хитозаном представлены в таблице 19.

Таблица 19.

Кинетические константы реакции гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosa и проростков пшеницы и константы ингибирования липаз хитозаном

Эффективность гидролазного действия растительной липазы на паранитрофенил пальмитат, выражаемая бимолекулярной константой kc_at/K_M, в 33 раза ниже, чем для липазы С.

С целью выяснения вклада электростатических взаимодействий положительно заряженных групп хитозана с отрицательно заряженными группами белка при образовании комплексов были изучены зависимости констант ингибирования липолитической активности хитозаном от концентрации добавленного в раствор хлорида натрия (рис. 14).

Был проведен расчет числа аминогрупп хитозана, образующих ионную пару с отрицательно заряженной группой белка.

Рис. 14. Зависимость в логарифмических координатах величин Kj липазы C.rugosa (1) и проростков пшеницы (2) хитозаном от концентрации хлорида натрия.

Величина п, численно равная тангенсу угла наклона прямых 1 или 2 к оси абсцисс на рис.14, имела значение 0,44 для липазы C.rugosa и 0,28 для липазы проростков пшеницы. Низкие значения величины п для обеих липаз свидетельствует о незначительном вкладе в свободную энергию комплексообразования электростатических взаимодействий зарядов хитозана и белка. С целью дополнительного подтверждения этого заключения мы провели измерения Kj грибной и растительной липаз низкомолекулярным N-сукцинил хитозаном.

Ингибирование активности липаз низкомолекулярным N-сукцинил хитозаном

В этом производном хитозана каждая сукцинильная группа несет отрицательный заряд.

ммоль¹» юш

*1

ммоль «каїн

Рис.15. Графики зависимостей в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой С.rugosa (а) и проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в

присутствии (2) N-сукцинил хитозана при pH 6,7 и 30°С

Близость значений К; обеих липаз хитозаном со свободными аминогруппами и N-сукцинил хитозаном подтверждает вывод о незначительной роли электростатических взаимодействий при комплексообразовании хитозана с липазами, подавляющего их ферментативную активность.

3.4.2.