1.7 Липолитические ферменты

Липазы (КФ 3.1.1.3) - ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз сложноэфирных связей в триглицеридах с образованием жирных

кислот и глицерина. Фермент производит гидролитическое расщепление триацилглицерола до диацилглицерола и остатка отщепляемой жирной кислоты.

Водорастворимые субстраты. Для выяснения механизма каталитического действия липолитических ферментов, можно проводить исследования с водорастворимыми субстратами. Липазы способны гидролизовать водорастворимые субстраты. Панкреатическая липаза атакует растворенный триацетин и трипропионин, хотя в этом случае существует корреляция между скоростью реакции и образованием мицелл [135].

Источники липолитических ферментов. Липолитические ферменты могут быть получены из трех источников: животных тканей, семян некоторых растений и микроорганизмов. Источником животной липазы является поджелудочная железа. В заметных количествах липаза содержится в семенах многих растений: пшеницы, ржи, овса, сои, хлопчатника, клещевины. Наиболее перспективным источником липаз являются микроорганизмы, так как животное и растительное сырье не может удовлетворить растущую потребность в липолитических препаратах.

бактерий найдены активные продуценты липаз, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter [136,137], Propionibacterium [138], Chromobacterium, Alcaligenes. Среди дрожжей лучшими продуцентами являются представители рода Candida (С. lipolytica, С. rugosa, С. paralipolytica, С. cylindraceae). Для промышленного использования чаще всего рекомендуются микроскопические грибы. Высокая липолитическая активность отмечается у грибов рода: Geotrichum, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Prnicillium, Oospora и Humicola. Продуценты липаз найдены и среди актиномицетов, среди которых можно назвать виды Streptomyces flavogriseus, Thermoactinomyces vulgaris.

Свойства липаз. Оптимум действия большинства липаз, за некоторыми исключениями лежит в области pH от 8 до 9. Липаза из клещевины наиболее активна при pH 4,2, у тканевых липаз липосомного происхождения оптимум pH ниже 5, а липазы из микроорганизма Mucor pusillus проявляют максимальную активность в области pH от 5 до 6.

Липолитические ферменты могут действовать в очень широком диапазоне температур; например, некоторые липазы микроорганизмов активны при - 20°С [139], а фермент из семян Vernonia anthelminthica - при 65°С. Для обнаружения активности многих липолитических ферментов требуются продолжительные периоды инкубации. Например, используя 30 мг фирменного препарата неочищенной панкреатической липазы свиньи, за 5-15 мин можно прогидролизовать в 200 мг очищенного оливкового масла 30-50% сложноэфирных связей с первичными гидроксильными группами глицерина. Однако этот препарат представляется собой сконцентрированный источник липаз, а большинство тканевых экстрактов обладает гораздо более низкой активностью. Инкубация продолжительностью более 15 мин приводит к ацильной миграции в 1,2(2,3) - диглицеридах и 2-моноглицеридах, являющихся наиболее вероятными продуктами липолиза, с образованием из них 1,3- и 1- изомеров[140].

Так как скорость липолиза является функцией концентрации субстрата, т.е.

Хлористый натрий активирует липолиз нерастворимых триглицеридов с длинной и короткой цепью, а также гидролиз растворимых триглицеридов с короткой цепью. Обнаруживаемые скорости ферментативного гидролиза триолеина, трибутирина, триацетина, оливкового масла все без исключения возрастают при добавлении соли. В случае триглицеридов с длинной цепью, таких, как триолеин, обнаруживаемое стимулирование панкреатического липолиза в значительной степени обусловлено наличием специфических компонентов реакционной смеси. Катионы уменьшают градиент pH на поверхности раздела и понижают кажущуюся рК_а жирных кислот, которые в таком случае могут быть оттитрованы более количественно. Однако роль хлористого натрия в липолизе триглицеридов с длинной цепью не ограничивается сдвигом кривой титрования. При полном отсутствие солей липолиз не протекает, даже при pH 9, в условиях, когда хотя бы часть олеиновой кислоты оттитровывается. Можно допустить, что при отсутствии каких-либо противоионов электростатическое отталкивание полностью препятствует либо связыванию фермент-суперсубстрат, либо связыванию фермент-субстрат. Большинство липаз ингибируется ионами металлов таких как: Hg ²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Со²⁺ и Cu²⁺ [141-145]. При добавлении Са²⁺ показана активация липолиза. Активация связана с удалением обладающих ингибиторными свойствами кислот с длинной

цепью путем образования кальциевых солей. Показано, что липолиз оливкового масла начинается с той же самой скоростью независимо от того, присутствуют ли ионы Са²⁺ или нет, но при отсутствии ионов Са²⁺ реакция очень скоро замедляется.

Специфичность. Субстратная специфичность липазы включает: 1)позиционную специфичность, т.е. способность гидролизовать в триглицеридах либо только первичные, либо и первичные, и вторичные эфирные связи; 2)стереоспецифичность, т.е. способность (гипотетическую) гидролизовать сложноэфирную связь только в положении 1 или только в положении 3 триглицерида; 3)предпочтительность к гидролизу сложноэфирных связей, образованных жирными кислотами с более длинной или с более короткой цепью, насыщенными или ненасыщенными; и в целом - зависимость скорости реакции от структуры субстрата.

Структура активного центра и поверхностная активация липазы. Известно, что липаза проявляет низкую активность по отношению к мономерным субстратам, напротив, в присутствии агрегатов молекул, так называемых суперсубстратов (капель жира), активность фермента значительно увеличивается [146]. Свойство поверхностной активации

отличает липазу от обычных эстераз, действующих на водорастворимые субстраты. Поэтому долгое время липазы рассматривали как специальную категорию эстераз, которые высокоэффективно гидролизуют молекулярные агрегаты липидов в воде.

Структура липазы, объясняющая поведение фермента на границе раздела фаз липид - вода, оставалась неразгаданной многие годы. И только в 1990г.

Было установлено, что поверхностная активация фермента осуществляется благодаря наличию у липазы амфифильной петли [147- 149], образованной сс-спиралью аминокислотной последовательности, прикрывающей активный центр фермента в отсутствие поверхности раздела фаз, и, следовательно, препятствующей доступу субстрата к каталитическому центру фермента. В результате контакта фермента с поверхностью раздела липид-вода происходит конформационное изменение структуры липазы, заключающееся в смещении петли, напоминающем открытие крышки [147-148,150]. Изменение положения «петли-крышки» открывает активный центр и большую гидрофобную поверхность фермента, отвечающую за связывание липазы с гидрофобным субстратом [150]. Важным доказательством участия амфифильной петли в поверхностной активации липаз является установление отсутствия эффекта поверхностной активации для липаз, в структуре которых петля или отсутствует, или является очень короткой. Так, липазы из Pseudomonas glumae [151], Candida antarctica (тип В) [152] имеют небольшую амфифильную петлю, закрывающую активный центр, и не проявляют поверхностной активации. Липаза из Pseudomonas aeruginosa также не проявляет поверхностной активации, что вызвано отсутсвием петли и необходимостью формирования открытой конформации фермента [153- 154]. Панкреатическая липаза морской свинки, имеющая амфифильную

мини-петлю, также не обладает свойством поверхностной активации [155]. Еще одним ярким примером необходимости петли в процессе активации липаз явилось изучение поведения двух мутантных форм панкреатической липазы, один из которых не содержал все петлевые домены, а второй - только a-петлю, прикрывающую активный центр фермента [156]. Оба мутанта имели очень низкую активность по отношению к эмульсии триглицерида по сравнению с нативной липазой, не активировались на поверхности раздела, гидролизовали водорастворимые субстраты с высокой скоростью, а также плохо связывались с субстратом в присутствии таурохолата натрия.

На сегодняшний день известны структуры большого числа липаз, свидетельствующие об отношении липазы к семейству «а / Р - гидролаз», состоящих из определенной последовательности а -спиралей и Р-листов.

1.7.1.